ایشان دومین فرزند پسر مرحوم شیخ سیدجواد خامنه ای است. پدرشان از روحانیون شناخته شده ساکن نجف بود که به تبریز و از آنجا به مشهد مهاجرت کرده بود.
دوران دبستان خود را در دارالتعلیم دیانتی مشهد گذراند، از کلاس پنجم همزمان تحصیل در حوزه را نیز آغاز کرد. ایشان در مشهد نزد علمایی چون آیت‌الله سید جلیل حسینی سیستانی، آیت‌الله حاج شیخ هاشم قزوینی و آیت‌الله سید محمدهادی میلانی کسب علم کردند. مدتی نیز در نجف نزد علمایی چون سید محسن حکیم، سید ابوالقاسم خویی، سید محمود شاهرودی، میرزا باقر زنجانی و میرزا حسن بجنوردی نیز تحصیل کردند. در حوزه قم نیز نزد بزرگانی چون آیات حاج آقا حسین بروجردی، امام خمینی، حاج شیخ مرتضی حائری یزدی، سید محمد محقق داماد و علامه طباطبایی به تحصیل علوم دینی پرداختند.
ایشان در سال 1343 به دلیل بیماری پدرشان به مشهد بازگشتند. در این دوره، تدریس فقه و اصول و برگزاری جلسات تفسیر قرآن خود را آغاز کردند، ایشان در جلسات، تفسیر مبانی اندیشه اسلامی و ذیل آن مبارزه با طاغوت را مطرح می کردند. علاوه بر این، از سال ۱۳۶۹ه. ش تدریس خارج فقه را آغاز کرده و تاکنون به تدریس ابواب جهاد، قصاص، مکاسب محرمه و صلاة مسافر پرداخته اند. از دیگر ابعاد علمی آیت الله خامنه ای می توان به گرایش ایشان به ادبیات فارسی اشاره کرد تا جایی که در ایام سکونت در مشهد با تخلص به «امین» شعر می سرودند و به محافل ادبی آن روز رفت و آمد داشتند.
جرقه فعالیت سیاسی ایشان به دیدار با شهید نواب صفوی باز می گردد، پس از آن نیز در سال 1336 با امام خمینی دیدار داشته و به جمع مبارزان با رژیم پهلوی می پیوندند. در سال 1341، بعد از برگزاری همه پرسی انجمن های ایالتی و ولایتی، مامور رساندن گزارش آیت الله میلانی به امام (س) شدند.
