ایشان دومین فرزند پسر مرحوم شیخ سیدجواد خامنه ای است. پدرشان از روحانیون شناخته شده ساکن نجف بود که به تبریز و از آنجا به مشهد مهاجرت کرده بود. 

دوران دبستان خود را در دارالتعلیم دیانتی مشهد گذراند، از کلاس پنجم همزمان تحصیل در حوزه را نیز آغاز کرد. ایشان در مشهد نزد علمایی چون آیت‌الله سید جلیل حسینی سیستانی، آیت‌الله حاج شیخ هاشم قزوینی و آیت‌الله سید محمدهادی میلانی کسب علم کردند. مدتی نیز در نجف نزد علمایی چون  سید محسن حکیم، سید ابوالقاسم خویی، سید محمود شاهرودی، میرزا باقر زنجانی و میرزا حسن بجنوردی نیز تحصیل کردند. در حوزه قم نیز نزد بزرگانی چون آیات حاج‌ آقا حسین بروجردی، ‌امام خمینی، حاج شیخ‌ مرتضی حائری یزدی، سید محمد محقق داماد و علامه طباطبایی به تحصیل علوم دینی پرداختند. 

ایشان در سال 1343 به دلیل بیماری پدرشان به مشهد بازگشتند. در این دوره، تدریس فقه و اصول و برگزاری جلسات تفسیر قرآن خود را آغاز کردند، ایشان در جلسات، تفسیر مبانی اندیشه اسلامی و ذیل آن مبارزه با طاغوت را مطرح می کردند. علاوه بر این، از سال ۱۳۶۹ه. ش تدریس خارج فقه را آغاز کرده و تاکنون به تدریس ابواب جهاد، قصاص، مکاسب محرمه و صلاة مسافر پرداخته اند. از دیگر ابعاد علمی آیت الله خامنه ای می توان به گرایش ایشان به ادبیات فارسی اشاره کرد تا جایی که در ایام سکونت در مشهد با تخلص به «امین» شعر می سرودند و به محافل ادبی آن روز رفت و آمد داشتند. 

جرقه فعالیت سیاسی ایشان به دیدار با شهید نواب صفوی باز می گردد، پس از آن نیز در سال 1336 با امام خمینی دیدار داشته و به جمع مبارزان با رژیم پهلوی می پیوندند. در سال 1341، بعد از برگزاری همه پرسی انجمن های ایالتی و ولایتی، مامور رساندن گزارش آیت الله میلانی به امام (س) شدند. 

در خرداد ماه سال 1342 به دلیل سخنرانی های مکرر علیه رژیم پهلوی بعد از ماجرای مدرسه فیضیه، بازداشت شدند. بهمن ماه همان سال نیز به دلیل فعالیت تبلیغی و سخنرانی در سیستان علیه نظام، بار  دیگر بازداشت و اسفند ماه با قرار التزام آزاد شدند. 

در سال 43 و بعد از تبعید امام به ترکیه، به همراه عبدالرحیم ربانی شیرازی، علی فیض مشکینی، ابراهیم امینی، مهدی حائری تهرانی، حسینعلی منتظری، احمد آذری قمی، علی قدوسی، اکبر هاشمی رفسنجانی، سید محمد خامنه‌ای و محمدتقی مصباح یزدی گروه 11 نفره ای را برای فعالیت منسجم روحانیون علیه رژیم وقت تشکیل و طی نامه ای به هویدا نسبت به تبعید امام موضع گیری کردند.

سال 1346 نیز برای سومین بار و به جرم عضویت در گروه «11 نفره» بازداشت و ممنوع الخروج شدند. در سال های آخر دهه 40، به دلیل سخنرانی در حسینیه ارشاد و مسجد الجواد در میان اقشار جوان و مذهبی محبوبیت پیدا کردند و با همراهی چهره هایی چون مرتضی مطهری، سید محمود طالقانی، سید ابوالفضل زنجانی، مهدی بازرگان، اکبر هاشمی رفسنجانی، یدالله سحابی، عباس شیبانی و کاظم سامی نقش مؤثری در تدوین ایدئولوژی اسلامی داشتند. همین ماجرا زمینه چهارمین بازداشت و ممنوع المنبری ایشان را فراهم کرد. 

در سال 50 نیز به دنبال فعالیت و سخنرانی هایی که علیه برگزاری جشن 2500 ساله انجام داده بودند، سه بار بازداشت شدند. سال 53 نیز در پی سخنرانی هایی که در مسجد جاوید تهران داشتند، بازداشت شدند و به گفته خودشان سخت ترین دوره زندان شان بوده است. در سال های میانی دهه 50، به ایرانشهر و جیرفت تبعید شدند. 

 

در آستانه  پیروزی انقلاب، به همراه گروهی دیگر از روحانیون به جمع تحصن کنندگان دانشگاه تهران پیوستند، بعد از انقلاب نیز  در جمع شورای انقلاب حضور داشتند. با ادغام شورای انقلاب و دولت موقت به معاونت امور انقلاب وزارت دفاع رفتند؛ سپس مسئولیت مرکز اسناد و نیز سرپرستی سپاه پاسداران انقلاب اسلامی به ایشان واگذار شد که با نامزدی ایشان برای حضور در انتخابات نخستین دوره مجلس شورای اسلامی و راه یابی به آن به پایان رسید.  

از دیگر اقدامات مؤثر ایشان می توان به تأسیس حزب جمهوری اسلامی به همراهی سید محمد حسینی بهشتی، اکبر هاشمی رفسنجانی، سید عبدالکریم موسوی اردبیلی و محمدجواد باهنر اشاره کرد. به دنبال ترور شهید بهشتی و شهید باهنر از سوی منافقان، ایشان به عنوان سومین و آخرین دبیرکل حزب انتخاب شدند. مهر ماه سال 60 با رأی مردم به عنوان سومین رئیس جمهور  انتخاب شد و تا سال 68 در این سمت  باقی ماند؛ دوران ریاست جمهوری ایشان همراه با تحولات دوران جنگ تحمیلی بود.

در سال 1368 و در پی رحلت امام خمینی (س) از سوی مجلس خبرگان رهبری به عنوان دومین رهبر انقلاب انتخاب شدند.